El análisis cualitativo y cuantitativo de los diferentes elementos que componen la sangre de un individuo aporta multitud de información acerca del estado de salud de este; entre los que encontramos, por ejemplo, el recuento de eritrocitos, leucocitos o plaquetas, los cuales pueden llevarse a cabo de diferentes formas. En concreto, el recuento de plaquetas en hemocitómetro persigue el objetivo de cuantificar el número de trombocitos de una muestra en un determinado volumen, a fin de establecer si dicha cantidad se encuentra en valores normales, o por el contrario presenta alguna anomalía.
¿Qué es un hemocitómetro o cámara de Neubauer?
El hemocitómetro o cámara de Neubauer puede considerarse un tipo de portaobjetos especializado en el conteo de células, para lo cual cuenta con una cuadrícula como la que aparece en la imagen de la portada.
Materiales para el recuento de plaquetas en hemocitómetro
- Muestra sanguínea con EDTA (anticoagulante)
- Solución diluyente: pudiendo utilizarse oxalato de amonio 1% o bien líquido de Rees Ecker. En ambos casos, con su aplicación conseguimos la lisis de los hematíes y evitar la agregación de las plaquetas. El líquido de Rees Ecker presenta la ventaja adicional de que incorpora en su composición un colorante azul, que facilita la visualización de las plaquetas al quedar teñidas de azul.
- Pipeta de Thoma de 101 ml o, en su defecto, una micropipeta y un eppendorf.
- Agitador (opcional)
- Hemocitómetro
- Cubreobjetos
- Microscopio de contraste de fases o microscopio óptico. El pequeño tamaño de los trombocitos hace que sean complicados de ver, y el microscopio de contraste facilita en parte esta tarea; si bien llegado el caso puede valernos el microscopio óptico (podremos verlos mejor si bajamos el condensador).
¡Ojo! Hemos dado la alternativa del uso del microscopio óptico ya que es el que solemos tener a mano con mayor frecuencia. Sin embargo, debemos tener en cuenta que, al presentar una mayor dificultad a la hora de visualizar las plaquetas, es mucho más probable que cometamos errores al realizar el conteo. Es por tanto una alternativa que nos sirve para poder realizar por ejemplo una práctica en el aula, pero no tiene una validez clínica precisamente por la alta tasa de error que podemos cometer.
Procesamiento de la muestra para el recuento de plaquetas en hemocitómetro
Dilución de la muestra para el recuento de leucocitos en hemocitómetro
El instrumento especializado en este proceso es la pipeta de Thoma. Existen dos variedades de ella en función del tipo de células sanguíneas que vayan a analizarse:
- La de 101 ml, en el caso de los eritrocitos (y también plaquetas)
- La de 11 ml, en el caso de los leucocitos.
Por tanto, en este caso será la de 101 ml la que precisaremos, siguiendo los pasos que se detallan a continuación:
- Tomamos 1 ml de la muestra sanguínea con la pipeta.
- Con un papel, limpiamos la punta de la pipeta de posibles restos de muestra que hayan podido quedar. Daremos además en el papel pequeños toques para enrasar justamente a 1 ml en caso de que sea necesario.
- Tomamos el líquido de Türk lentamente hasta enrasar la pipeta a la señal de 101.
¡Ojo! Si no disponemos de pipeta de Thoma, será suficiente hacer una dilución 1/100 en un tubo eppendorf, la cual es la dilución recomendada para este protocolo. Ten en cuenta que el factor de dilución será necesario más adelante para poder extrapolar los datos obtenidos a la muestra original.
- Agitamos de 2 a 3 minutos en el agitador o, en su defecto, manualmente, para obtener una muestra homogénea.
Llenado de la cámara para el recuento de plaquetas en hemocitómetro
Colocamos un cubreobjetos sobre el hemocitómetro y, ya sea con la propia pipeta de Thoma o tomando 10 µl de la dilución hecha en el eppendorf, vamos llenando la cámara desde un extremo con la muestra hasta completarla, haciéndolo con precaución para que no se desborde ni se creen burbujas.
Recuento de plaquetas en hemocitómetro
- Ponemos el hemocitómetro sobre la platina del microscopio óptico, y lo primero que deberemos hacer será dejar reposar la muestra 2-3 minutos para que las plaquetas sedimenten y podamos visualizarlos mejor.
- Pasado el tiempo, enfocamos en primer lugar a 4x para identificar los diferentes cuadrantes del hemocitómetro.
En este caso, será el cuadrante central el que utilizaremos para el conteo, tal y como se representa en la siguiente imagen.
3. Una vez localizado el cuadrante, aumentaremos a 40x y contaremos las plaquetas que hay en él.
Para ello, iremos haciendo un barrido por cada uno de los 25 cuadrantes pequeños que componen cada cuadrante lateral, tal como se muestra en la siguiente imagen, y siguiendo el método de la “L”. Este método consiste en que, si en un determinado cuadrante hay plaquetas localizadas justo en las líneas que lo delimitan, se contarán solo aquellas localizados sobre la “L” imaginaria (ver imagen 3). Con ello, conseguimos no contar dos veces la misma plaqueta en dos cuadrantes diferentes. ¡Ojo! Hay que tener cuidado con los cuadrantes superiores y del lateral derecho, en ellos sí deben contabilizarse las plaquetas de todos los límites, al no haber otros cuadrantes contiguos en los que se vayan a contabilizar posteriormente.
4. Una vez contabilizadas las plaquetas, procedemos a realizar los cálculos para conocer cuántas había en la muestra origen:
- En primer lugar, debemos saber en qué volumen se contiene dicha cantidad de plaquetas.
Para ello, sabemos que el cuadrante central tiene unas dimensiones de 1 x 1 mm. Además, tiene una profundidad de 0,1 mm. Con todo ello, si multiplicamos estos valores (1 x 1 x 0,1 mm) obtenemos un volumen de 0,1 mm3.
Si necesitamos transformar esta unidad de medida, debemos saber que 1 ml = 103 mm3 y que 1 ml = 103 µl. Por tanto, otra forma de expresarlo es que el volumen total del cuadrante central es de 0,1 µl.
- Para poder dar el valor en un volumen de 1 µl, multiplicamos el número de plaquetas x10. Obtenemos así el número de plaquetas / µl en la muestra diluida.
- Por último, lo que nos queda es aplicar el factor de dilución para concluir cuántas plaquetas / µl hay en la muestra origen (sin diluir). Para ello, lo único que debemos hacer es multiplicar por 100 (ya que la muestra estaba diluida 100 veces).
En resumen, la fórmula simplificada sería:
Total de plaquetas contabilizadas en el cuadrante central x 10 x 100 = nº plaquetas / µl
Comparación de los resultados obtenidos con los valores de referencia
Los datos obtenidos no aportan en sí mismos información alguna, si no podemos compararlos con los valores de referencia, de forma que nos permitan saber si el individuo presenta unos valores normales, o por el contrario presenta alguna trombocitopenia o trombocitosis (valores de plaquetas por debajo y por encima de los valores considerados normales, respectivamente). En los dos últimos casos, puede ser debido a múltiples causas, y debe investigarse de forma más exhaustiva, ya que puede ser indicio de alguna patología.
Los valores de referencia habituales para el recuento de plaquetas son 172 – 450 x 103 plaquetas / μL
Bibliografía
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