El análisis cualitativo y cuantitativo de los diferentes elementos que componen la sangre de un individuo aporta multitud de información acerca del estado de salud de este; entre los que encontramos, por ejemplo, el recuento de eritrocitos, leucocitos o plaquetas, los cuales pueden llevarse a cabo de diferentes formas. En concreto, el recuento de leucocitos en hemocitómetro, persigue el objetivo de cuantificar el número de glóbulos blancos de una determinada muestra en un determinado volumen, a fin de determinar si dicha cantidad se encuentra en valores normales, o por el contrario presenta alguna anomalía.
¿Qué es un hemocitómetro o cámara de Neubauer?
El hemocitómetro o cámara de Neubauer puede considerarse un tipo de portaobjetos especializado en el conteo de células, para lo cual cuenta con una cuadrícula como la que aparece en la imagen de la portada.
Materiales para el recuento de leucocitos en hemocitómetro
- Muestra sanguínea con EDTA (anticoagulante)
- Líquido de Türk, líquido hipotónico compuesto por un colorante (que tiñe ligeramente los leucocitos) y ácido acético (que lisa los eritrocitos, permitiendo visualizar más fácilmente los leucocitos).
- Pipeta de Thoma de 11 ml o, en su defecto, una micropipeta y un eppendorf.
- Agitador (opcional)
- Hemocitómetro
- Cubreobjetos
- Microscopio óptico
Procesamiento de la muestra para el recuento de leucocitos en hemocitómetro
Dilución de la muestra para el recuento de leucocitos en hemocitómetro
El instrumento especializado en este proceso es la pipeta de Thoma. Existen dos variedades de ella en función del tipo de células sanguíneas que vayan a analizarse:
- La de 101 ml, en el caso de los eritrocitos.
- La de 11 ml, en el caso de los leucocitos.
Por tanto, en este caso será la de 11 ml la que precisaremos, siguiendo los pasos que se detallan a continuación:
- Tomamos 0,5 ml de la muestra sanguínea con la pipeta.
- Con un papel, limpiamos la punta de la pipeta de posibles restos de muestra que hayan podido quedar. Daremos además en el papel pequeños toques para enrasar justamente a 0,5 ml en caso de que sea necesario.
- Tomamos el líquido de Türk lentamente hasta enrasar la pipeta a la señal de 11.
¡Ojo! Si no disponemos de pipeta de Thoma, será suficiente hacer una dilución de 50 µl de sangre en 950 µl de diluyente.
- Agitamos de 2 a 3 minutos en el agitador o, en su defecto, manualmente, para obtener una muestra homogénea.
A estas alturas, es muy importante tener en cuenta que tenemos una dilución 1/20; la cual es la dilución estandarizada para este protocolo. Este factor de dilución será necesario más adelante para poder extrapolar los datos obtenidos a la muestra original.
Llenado de la cámara para el recuento de leucocitos en hemocitómetro
Colocamos un cubreobjetos sobre el hemocitómetro y, ya sea con la propia pipeta de Thoma o tomando 10 µl de la dilución hecha en el eppendorf, vamos llenando la cámara desde un extremo con la muestra hasta completarla, haciéndolo con precaución para que no se desborde ni se creen burbujas.
Recuento de leucocitos en hemocitómetro
- Ponemos el hemocitómetro sobre la platina del microscopio óptico, y lo primero que deberemos hacer será dejar reposar la muestra 2-3 minutos para que los leucocitos sedimenten y podamos visualizarlos mejor.
- Pasado el tiempo, enfocamos en primer lugar a 4x para identificar los diferentes cuadrantes del hemocitómetro.
En este caso, serán los cuatro cuadrantes laterales los que utilizaremos para el conteo, tal y como se representa en la siguiente imagen.
3. Una vez localizados los cuadrantes sobre los cuales debemos realizar el conteo, aumentaremos a 40x y contaremos los leucocitos que hay en cada cuadrante.
Para ello, iremos haciendo un barrido por cada uno de los 16 cuadrantes pequeños que componen cada cuadrante lateral, tal como se muestra en la imagen 3, y siguiendo el método de la “L”. Este método consiste en que, si en un determinado cuadrante hay leucocitos localizados justo en las líneas que lo delimitan, se contarán solo aquellos localizados sobre la “L” imaginaria (imagen 3). Con ello, conseguimos no contar dos veces el mismo leucocito en dos cuadrantes diferentes. ¡Ojo! Hay que tener cuidado con los cuadrantes superiores y del lateral derecho, en ellos si deben contabilizarse los leucocitos de todos los límites, al no haber otros cuadrantes contiguos en los que se vayan a contabilizar dichos leucocitos.
4. Una vez contabilizados los leucocitos de los 4 cuadrantes, procedemos a realizar los cálculos para conocer cuántos había en la muestra origen:
- En primer lugar, sumaremos los glóbulos blancos contados en total y lo dividiremos entre 4 para hacer la media.
- A continuación, debemos saber en qué volumen se contiene dicha cantidad de leucocitos.
Para ello, sabemos que cada uno de los cuadrantes laterales tiene unas dimensiones de 1 x 1 mm. Además, tiene una profundidad de 0,1 mm. Con todo ello, si multiplicamos estos valores (1 x 1 x 0,1 mm) obtenemos un volumen de 0,1 mm3.
Si necesitamos transformar esta unidad de medida, debemos saber que 1 ml = 103 mm3 y que 1 ml = 103 µl. Por tanto, otra forma de expresarlo es que el volumen total de un cuadrante lateral 0,1 µl.
- Para poder dar el valor en un volumen de 1 µl, multiplicamos el número de leucocitos x10. Obtenemos así el número de leucocitos / µl en la muestra diluida.
- Por último, lo que nos queda es aplicar el factor de dilución para concluir cuántos leucocitos / µl hay en la muestra origen (sin diluir). Para ello, lo único que debemos hacer es multiplicar por 20 (ya que la muestra estaba diluida 20 veces).
En resumen, la fórmula simplificada sería:
Total de leucocitos contabilizados en los cuatro cuadrantes x 10 x 20 / 4 = nº leucocitos / µl
Comparación de los resultados obtenidos con los valores de referencia
Los datos obtenidos no aportan en sí mismos información alguna, si no podemos compararlos con los valores de referencia, de forma que nos permitan saber si el individuo presenta unos valores normales, o por el contrario presenta alguna leucopenia o leucocitosis (valores de leucocitos por debajo y por encima de los valores considerados normales, respectivamente). En los dos últimos casos, puede ser debido a múltiples causas, y debe investigarse de forma más exhaustiva, ya que puede ser indicio de alguna patología.
Los valores de referencia habituales para el recuento de leucocitos son 4300 – 10000 leucocitos / μL
Bibliografía
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