El análisis cualitativo y cuantitativo de los diferentes elementos que componen la sangre de un individuo aporta multitud de información acerca del estado de salud de este; entre los que encontramos, por ejemplo, el recuento de eritrocitos, leucocitos o plaquetas, los cuales pueden llevarse a cabo de diferentes formas. En concreto, el recuento de eritrocitos en hemocitómetro, persigue el objetivo de cuantificar el número de glóbulos rojos de una determinada muestra en un determinado volumen, a fin de determinar si dicha cantidad se encuentra en valores normales, o por el contrario presenta alguna anomalía.
¿Qué es un hemocitómetro o cámara de Neubauer?
El hemocitómetro o cámara de Neubauer puede considerarse un tipo de portaobjetos especializado en el conteo de células, para lo cual cuenta con una cuadrícula como la que aparece en la imagen de la portada.
Materiales para el recuento de eritrocitos en hemocitómetro
- Muestra sanguínea con EDTA (anticoagulante)
- Líquido de Hayem, líquido isotónico que se utiliza para diluir la muestra.
- Pipeta de Thoma de 101 ml o, en su defecto, una micropipeta y un eppendorf.
- Agitador (opcional)
- Hemocitómetro
- Cubreobjetos
- Microscopio óptico
Procesamiento de la muestra para el recuento de eritrocitos en hemocitómetro
Dilución de la muestra para el recuento de eritrocitos en hemocitómetro
El instrumento especializado en este proceso es la pipeta de Thoma. Existen dos variedades de ella en función del tipo de células sanguíneas que vayan a analizarse:
- La de 101 ml, en el caso de los eritrocitos.
- La de 11 ml, en el caso de los leucocitos.
Por tanto, en este caso será la de 101 ml la que precisaremos, siguiendo los pasos que se detallan a continuación:
- Tomamos 0,5 ml de la muestra sanguínea con la pipeta.
- Con un papel, limpiamos la punta de la pipeta de posibles restos de muestra que hayan podido quedar. Daremos además en el papel pequeños toques para enrasar justamente a 0,5 ml en caso de que sea necesario.
- Tomamos el líquido de Hayem lentamente hasta enrasar la pipeta a la señal de 101.
¡Ojo! Si no disponemos de pipeta de Thoma, será suficiente hacer una dilución de 5 µl de sangre en 995 µl de diluyente.
- Agitamos de 2 a 3 minutos en el agitador o, en su defecto, manualmente, para obtener una muestra homogénea.
A estas alturas, es muy importante tener en cuenta que tenemos una dilución 0,5/100 o, dicho de otra forma, 1/200; la cual es la dilución estandarizada para este protocolo. Este factor de dilución será necesario más adelante para poder extrapolar los datos obtenidos a la muestra original.
Llenado de la cámara para el recuento de eritrocitos en hemocitómetro
Colocamos un cubreobjetos sobre el hemocitómetro y, ya sea con la propia pipeta de Thoma o tomando 10 µl de la dilución hecha en el eppendorf, vamos llenando la cámara desde un extremo con la muestra hasta completarla, haciéndolo con precaución para que no se desborde ni se creen burbujas.
Recuento de eritrocitos en hemocitómetro
- Ponemos el hemocitómetro sobre la platina del microscopio óptico, y lo primero que deberemos hacer será dejar reposar la muestra 2-3 minutos para que los eritrocitos sedimenten y podamos visualizarlos mejor.
- Pasado este tiempo, enfocamos en primer lugar a 4x para identificar los diferentes cuadrantes del hemocitómetro.
En este caso, será el cuadrante central el que utilizaremos para el conteo, en concreto 5 (los 4 de las esquinas y el central) de los 25 cuadrantes pequeños que componen dicho cuadrante, tal y como se representa en la imagen 2.
3. Una vez localizados los cuadrantes sobre los cuales debemos realizar el conteo, aumentaremos a 40x y contaremos los eritrocitos que hay en cada cuadrante.
Para ello, tenemos que tener en cuenta que, como se puede observar en la imagen 3, solo tendremos en cuenta los eritrocitos que se encuentren dentro del cuadrante pequeño que estamos analizando o bien tocando la línea interna y/o intermedia que lo delimita, ignorando aquellos eritrocitos que toquen la línea externa.
¡Ojo! Antes de proceder con una contabilización exhaustiva de cada uno de los cuadrantes, se recomienda hacer un barrido rápido para observar si la muestra está distribuida de forma homogénea. De haber una diferencia mayor a un 25% de los eritrocitos presentes en los diferentes cuadrantes, el procedimiento debe repetirse.
4. Una vez contabilizados los eritrocitos de los 5 cuadrantes, procedemos a realizar los cálculos para conocer cuántos había en la muestra origen:
- En primer lugar, para hacer una extrapolación de cuántos eritrocitos hay en el cuadrante central, sumaremos los glóbulos rojos contados en los cinco cuadrantes pequeños que hemos contado y esa cifra la multiplicamos por 5 (ya que el cuadrante central está compuesto como hemos dicho por 25 cuadrantes pequeños).
- A continuación, debemos saber en qué volumen es el que se contienen dicha cantidad de eritrocitos.
Para ello (como vemos en la imagen 2), sabemos que cada uno de los cuadrantes pequeños tiene unas dimensiones de 0,2 x 0,2 mm. Por tanto, el cuadrante grande tiene unas de 1 x 1 mm. Además, tiene una profundidad de 0,1 mm. Con todo ello, si multiplicamos estos valores (1 x 1 x 0,1 mm) obtenemos un volumen de 0,1 mm3.
Si necesitamos transformar esta unidad de medida, debemos saber que 1 ml = 103 mm3 y que 1 ml = 103 µl. Por tanto, otra forma de expresarlo es que el volumen total del cuadrante central es de 0,1 µl.
- Para poder dar el valor en un volumen de 1 µl, multiplicamos el número de eritrocitos x10. Obtenemos así el número de eritrocitos / µl en la muestra diluida.
- Por último, lo que nos queda es aplicar el factor de dilución para concluir cuántos eritrocitos / µl hay en la muestra origen (sin diluir). Para ello, lo único que debemos hacer es multiplicar por 200 (ya que la muestra estaba diluida 200 veces).
En resumen, la fórmula simplificada sería:
Total de eritrocitos contabilizados en los 5 cuadrantes pequeños x 5 x 10 x 200 = nº eritrocitos / µl
Comparación de los resultados obtenidos con los valores de referencia
Los datos obtenidos no aportan en sí mismos información alguna, si no podemos compararlos con los valores de referencia, de forma que nos permitan saber si el individuo presenta unos valores normales, o por el contrario presenta alguna anemia o eritrocitosis (valores de eritrocitos por debajo y por encima de los valores considerados normales, respectivamente). En los dos últimos casos, puede ser debido a múltiples causas, y debe investigarse de forma más exhaustiva, ya que puede ser indicio de alguna patología.
Los valores de referencia habituales para el recuento de eritrocitos son:
- En mujeres: 4,0 – 5,4 x 106 eritrocitos/μL
- En hombres: 4,5 – 6 x 106 eritrocitos/μL
Bibliografía
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